|
|
Mechanismy transmembránového transportu auxinu v širším evolučním kontextu.
Rubešová, Magdaléna ; Petrášek, Jan (vedoucí práce) ; Tylová, Edita (oponent)
Auxin, reprezentovaný molekulou indol-3-octové kyseliny (IAA), je jedním z hlavních fytohormonů podílející se na regulaci vývoje rostlin. Jeho mezibuněčný transport utváří v jednotlivých buňkách koncentrační gradienty, které řídí genovou expresi a řadu navazujících procesů. U rostlin se pro efektivní transport IAA v evoluci vyvinul komplexní mechanismus, který zahrnuje jak její dopravu na dlouhé vzdálenosti, tak transport na mezibuněčné úrovni v rámci jednotlivých pletiv. Protože naše poznání mechanismů přenašečového transportu auxinu není stále úplné, snaží se tato práce shrnout literární údaje o všech doposud poznaných způsobech jeho dopravy přes buněčné membrány a zasazuje je do širšího evolučního kontextu. Přítomnost IAA v mnoha prokaryotních í eukaryotních organismech, spolu s podobně širokým výskytem evolučně příbuzných přenašečů podobných auxinovým přenašečům typu PIN- FORMED, poukazuje na možnost, že i transport IAA může být evolučně velmi starobylý a může funkčně vycházet z obecnějších mechanismů transportu iontů či aminokyselin.
|
|
|
Role aktinového cytoskeletu při umisťování auxinových přenašečů v plazmatické membráně.
Kebrlová, Štěpánka ; Petrášek, Jan (vedoucí práce) ; Pernisová, Markéta (oponent)
Auxin hraje významnou morfogenní roli ve vývoji rostlin, zejména díky jeho účinku na genovou expresi, ale i řadu rychlejších dějů, které jsou přímo závislé na jeho koncentraci. Proto je v mnoha rostlinných pletivech směrovaný transport auxinu, zajišťovaný specifickými přenašeči v plazmatické membráně, důležitý pro koordinaci morfogenních stimulů. Množství auxinových přenašečů v plazmatické membráně přímo ovlivňuje výslednou koncentraci auxinu uvnitř buňky. Ačkoliv se dá předpokládat, že lokalizace auxinových přenašečů a jejich množství v plazmatické membráně jsou určovány především aktinovým cytoskeletem a jeho zapojením v procesech váčkového transportu, není v současné době tento vztah stále vyjasněn. Proto nás v této práci zajímalo, jak je lokalizace a funkce auxinových přenašečů ovlivněna v případě, že je v daném buněčném typu postižena funkce aktinového cytoskeletu. K tomuto účelu byla studována lokalizace auxinových přenašečů PIN3, PIN4, PIN7 a AUX1 v pokožkových buňkách velmi mladých děložních listů Arabidopsis thaliana, jejichž morfogeneze byla postižena mutacemi v podjednotkách aktinového nukleačního komplexu ARP2/3. Byly připraveny kříženci mutantů v podjednotkách komplexu ARP2/3 s markerovými liniemi nesoucí fluorescenčně označené auxinové přenašeče a sensory auxinem řízené genové...
|
|
|
Vliv ethinylestradiolu na Na+, K+ - ATPázu
Kettnerová, Karolína ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Driák, Daniel (oponent)
Diplomová práce je zaměřena na studium fyziologického vlivu syntetického estrogenu ethinylestradiolu (EE), který je obsažen v preparátech orálně užívané hormonální antikoncepce. Z velkého množství fyziologicky významných molekul, jejichž exprese či funkce by mohla být EE ovlivněna, se práce zaměřuje na studium vlivu EE na sodíkem a draslíkem aktivovanou adenosintrifosfatázu (Na+, K+ - ATPázu), která je selektivně inhibována kardioaktivními glykosidy, jmenovitě ouabainem (g- strofantinem). Jedná se o významný, membránově vázaný enzym, který katalyzuje aktivní transport sodných draselných přes plazmatickou membránu. Pro tyto účely byla v první části experimentů využita metoda vazby [3H]ouabainu na Na+, K+ - ATPázu. V druhé části experimentu byla pomocí rovnovážné anizotropie DPH studována fluidita plazmatické membrány. Účinek EE na Na+, K+ - ATPázu byl studován jednak v podmínkách in vitro v buněčné linii HEK293 (inkubace 24 hod v živném médiu), tak v podmínkách in vivo po subkutánním podáním samicím potkanů kmene Wistar (10 dní). Výsledky získané při studiu HEK293 buněk ukázaly, že EE zvyšuje specifickou vazbu [3H]ouabainu ve frakcích plasmatických membrán, které byly připraveny flotací v hustotním sacharózovém gradientu. Výsledky účinku EE na vazbu [3H]ouabainu na podbuněčné preparáty (postnukleární...
|
|
|
Caveolae and caveosoms
Galica, Tomáš ; Černý, Jan (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent)
Kaveoly sú pozoruhodne stabilné štruktúry na plazmatickej membráne. Vytvárajú špecifické domény líšiace sa od zvyšku plazmatickej membrány v lipidovom zložení. Kaveolám sa pripisuje mnoho rôznych funkcií. Sú to napríklad modulácia bunkového povrchu, signalizácia a predovšetkým dobre regulovaná endocytóza. Kaveozómy majú byť veľké vnútrobunkové vezikulárne štruktúry predstavujúce potenciálne nové membránové organely. Odvodené sú od internalizovaných kaveol. Spolu s kaveolami majú predstavovať oddelený systém intracelulárnych vačkov. Nedávne pozorovania však ukazujú, že kaveoly sú schopné fúzovať s endozómami vzápätí po oddelení sa od plazmatickej membrány. Ak je to tak potom môže byť systém odvodený od kaveol, včítane kaveozómov, považovaný za regulérnu súčasť endozomálneho systému. Izolácia kaveozómov od endozómov bola pozorovaná najmä v experimentoch v ktorých bol použitý polyomavírus SV40. Vynára sa teda otázka, či táto izolácia nie je len dôsledkom infekcie SV40. Nedávno sa ukázalo, že SV40 je schopný navodzovať vznik štruktúr podobných kaveozómom aj v neprítomnosti kaveol. V dôsledku týchto zistení sú existencia a vlastnosti kaveozómov spochybňované. Dôležitým problémom je vznik kaveozómov a ich existencia v neprítomnosti SV40. V tejto práci sú zhrnuté princípy, ktoré môžu viesť k vzniku...
|
|
|
Analýza lokalizace endomembránových markerů v kortikální vrstvě rostlinných buněk a jejich interakce s komplexem Arp2/3
Jelínková, Barbora ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Fendrych, Matyáš (oponent)
ARP2/3 je evolučně konzervovaný heterohemptamerický proteinový komplex. Jeho hlavní aktivitou je nukleace větvených aktinových vláken za účelem remodelace membrán. ARP2/3 se účastní remodelace plazmatické membrány a tvorby cytoplazmatických výběžků sloužících k pohybu u živočišných buněk a améboidních prostist a účastní se exocytózy a endocytózy u živočichů a kvasinek. Cílem této práce bylo pokusit se najít souvislost komplexu ARP2/3 s regulací endomembránového systému u rostlin. Pomocí TIRF mikroskopie byla prozkoumána lokalizace komplexu ARP2/3 v kortikální vrstvě rostlinných buněk a porovnána s lokalizací endomembránových markerů ze skupiny Rab a exocytotickým markerem Exo84b. Podjednotky komplexu ARP2/3 lokalizovaly v blízkosti plazmatické membrány do dynamických teček nejvíce se podobajících lokalizaci Exo84b proteinu. Kolokalizační analýza ukázala malou míru kolokalizace signálu Exo84b a ARP2/3 a tento výsledek byl podpořen biochemickým přístupem koimunoprecipitace. Klíčová slova: ARP2/3, endomembránový systém, kortikální vrstva, RabA1g, RabC1, RabD2a, Exo84b,
|
|
|
Effect of amyloid β on the function of endosomes and lysosomes
Tmějová, Monika ; Rudajev, Vladimír (vedoucí práce) ; Búran, Peter (oponent)
Amyloid β (Aβ) vzniká proteolytickým štiepením amyloidového prekurzorového proteínu (APP). Hromadenie toxických foriem Aβ v lyzozómoch a endozómoch je považované za jeden z prvých prejavov Alzheimerovej choroby (AD). AD je neurodegeneratívne ochorenie, ktoré bolo prvý krát popísané v roku 1907 Aloisom Alzheimerom. Toto ochorenie najčastejšie postihuje starších jedincov vo veku nad 65 rokov a v súčasnosti je najrozšírenejšou formou demencie. V posledných rokoch bol zaznamenaný významný pokrok v identifikovaní jednotlivých génov, ktoré by mohli byť zodpovedné za vznik ochorenia, ale kľúčový mechanizmus vzniku patologických senilných plakov a neurofibrilárnych pletencov zostáva stále neodhalený. Vezikulárny transport zohráva dôležitú úlohu v regulácii APP a v tvorbe Aβ. Táto práca popisuje jednotlivé molekulárne mechanizmy, ktoré podporujú patologický vplyv hromadenia Aβ v endolyzozomálnom komplexe.
|
|
|
Interakce amyloidu β s proteiny neuronálních membrán
Manová, Blanka ; Rudajev, Vladimír (vedoucí práce) ; Černá, Barbora (oponent)
Amyloid b (Ab) je výsledný produkt amyloidního štěpení jeho prekurzovového proteinu (APP) pomocí b a γ sekretáz. Dle amyloidní hypotézy je hlavní příčinou časných patogenetických událostí Alzheimerovy choroby (AD), která je dnes nejčastějším neurodegenerativním onemocněním na světě bez existence účinné léčby. Za hlavní patogenezi nemoci je považována ztráta synapsí, narušení plasticity neuronů a neurodegenerace. Amyloid b se může přímo vázat na membránu nebo zprostředkovávat poškození neuronů nepřímo za vzniku toxických zánětlivých mediátorů (reaktivních kyslíkových meziproduktů, NO, cytokinů) aktivací mikroglií a astrocytů. Ab se váže na různé receptory plazmatické membrány a také může přímo interagovat s buněčným povrchem a narušovat membránovou integritu nebo vytvářet selektivní kationtové kanály. Tato práce přibližuje klíčové interakce s membránami synapsí a mechanismy toxicity vyvolané amyloidem prostřednictvím receptorů.
|
|
|
Cell signalling and molecular complexes of the TRH receptor
Drastichová, Zdeňka
První část disertační práce se zabývá identifikací proteinů isolovaných ve frakci obohacené o plasmatické membrány získané z buněčné linie HEK293-E2M11, jejichž hladina byla změněna po dlouhodobém působení thyroliberinem. Pomocí imunoblotu se specifickými protilátkami proti Na+ ,K+ - ATPase a vazebných pokusů s [3 H]TRH a [35 S]GTPγS bylo zjištěno, že frakce obohacená o plasmatické membrány obsahovala v porovnání s postnukleárním supernatantem výrazně vyšší množství Na+ ,K+ - ATPasy, TRH receptoru and G-proteinů. Pro detekci a identifikaci proteinů ve frakci obohacené o plasmatické membrány, jejichž hladiny byly po dlouhodobém působení TRH (16 h; 10 μM) změněny, byly použity 2D-elektroforéza a hmotnostní spektrometrie. Bylo identifikováno 42 proteinů, z nichž pět proteinů (mitofilin, MTHSP75, prohibitin, stomatin like-2, peroxiredoxin III) představuje mitochondriální proteiny, které jsou důležité pro správnou strukturu a funkci mitochondrií. Hladina těchto proteinů byla zvýšena po dlouhodobém působení TRH, a proto lze usuzovat, že dlouhodobé působení TRH může výrazně ovlivnit mitochondriální membránu a funkci mitochondrií. Druhá část disertační práce se zabývá identifikací molekulárních komplexů TRH receptoru a/nebo Gq/11 proteinu. Pomocí nativní elektroforézy byly identifikovány tři komplexy...
|
|
|
Modulační vliv monovalentních iontů na δ-opioidní receptory
Vošahlíková, Miroslava ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Jakubík, Jan (oponent) ; Kršiak, Miloslav (oponent)
Přesná role opioidních receptorů v drogové závislosti a také modulační mechanizmus, jakým jsou tyto receptory ovlivňovány monovalentními ionty, nejsou doposud zcela vysvětleny. Naše výsledky podporují názor, že mechanizmus závislosti na morfinu je primárně založen na desenzitizaci odpovědi μ- a δ-opioidních receptorů. Desenzitizace nastává již na úrovni funkční aktivity G proteinů. Dlouhodobé vystavení potkanů působení morfinu mělo za následek zvýšení počtu δ-opioidních receptorů a změnu jejich citlivosti vůči sodným iontům. Analýza inhibičního vlivu různých monovalentních iontů na vazbu agonisty v buněčné linii δ-OR-Gi1α (Cys351 -Ile351 )-HEK293 potvrdila preferenční citlivost δ-opioidního receptoru k sodným iontům. Podařilo se nám rozlišit vysoko- a nízkoafinní vazebná místa pro sodné ionty. Biofyzikální analýza interakce iontů lithia, sodíku, draslíku a cesia s plazmatickou membránou buněk HEK293 pomocí fluorescenčních technik ukázala na význam polárních skupin přítomných v povrchové vrstvě membrány. Právě do této oblasti je možné umístit vazebná místa s nízkou afinitou. Klíčová slova: morfin, frontální mozková kůra, opioidní receptory, G proteiny, monovalentní ionty, plazmatická membrána, metody fluorescenční spektroskopie.
|
|
|
Evolučně-vývojové studium membránových proteinů
Vosolsobě, Stanislav ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Štorchová, Helena (oponent)
Evolučně-vývojové studium membránových proteinů Mgr. Stanislav Vosolsobě Školitelka: Kateřina Schwarzerová Disertační práce Abstrakt Různými přístupy fylogenetické a funkční analýzy vybraných membránových signálních proteinů jsem přinesl nové důkazy, které podporují hypotézu, že molekulární evoluce proteinových rodin je výrazně dynamický, nikoliv konzervativní, proces. U rodiny periferních plasmalemových proteinů DREPP vázajících vápník, které jsou specifické pro rostlinou linii Euphyllophyta, jsem nalezl mnoho nezávislých genových duplikací spojených s vysokou flexibilitou způsobu, jakým proteiny interagují s membránou. Porovnáním třech rodin proteinů zajišťujících transport auxinu, PIN-FORMED, LAX a PILS, jsem zjistil, že se objevily na zcela odlišných úrovních evolučního stromu rostlinné říše, a ačkoliv se podílejí na fundamentálních morfogenních procesech, jako je buněčná diferenciace, zakládání orgánů a tropismy, přičemž jejich ztrátové mutace mají velmi silný fenotypový projev, prodělaly tyto genové rodiny na různých taxonomických úrovních řadu duplikací a ztrát, z čehož vyplývá, že i klíčové fyziologické procesy sdílené napříč rostlinami mohou být vykonávány proteiny podléhajícími současné evoluci. Evolučně- vývojová syntéza funkčních a fylogenetických výsledků musí být tudíž konána s velkou...
|
host ::
RSS.